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常规液相色谱柱维护

正确的使用色谱柱是极其重要的,并且对液相分析非常有帮助的。接下来的文章是一些使用、清洗和保存液相色谱柱的指导。这些指导根据两方面来分的,一方面是根据色谱柱的基质(硅胶,聚合物或者其他),另一方面是表面键和的化学固定相。

常识

硅胶是理想的液相色谱柱的基质,它可以提供高的机械强度的固定,杰出的物理化学表面特点,广泛的键和化学适合广泛的有机溶剂。但是接下来这些方面是极其重要的需要了解当色谱柱用硅胶作为固定相。

PH稳定性

一般情况下,色谱柱的PH允许范围为2-8,如果要测量PH,一般需要在和有机洗脱溶剂混合之前测水相的。现在有色谱柱的PH适用范围超过了2-8。新的键和某些固定相可以在PH低于1的情况下使用。当所购买的柱子使用范围超过了2-8,需要使用前找销售商询问产品的相关信息。但是使用寿命最好的情况还是控制PH在2-6.8的范围。如果固定相是以高纯硅胶为基质的,那么PH甚至可以跑到11以上,主要看用在流动相中修饰剂的化学结构,大的碱基(例如吡咯烷酮)不能攻击到硅胶表面,可以跑比较高的PH值;如果在PH值高于8用小的碱基(例如氨基)作为修饰剂,我们则高度建议用聚合物基质或者氧化锆基质作为固定相。

机械稳定性

固定相键和在硅胶表面,机械强度非常稳定,填充柱没有展现出来的是没有压力限制并且在超过40Mpa的情况下没有任何问题。但是需要避免强烈撞击柱子,否则会导致柱床断裂,从而进一步导致峰分叉在对应的色谱图中。

流动相(洗提液)

硅胶基质的固定相适合以上PH范围内的所有有机溶剂,请使用高质量的有机试剂(色谱级),另外,在上液相系统之前,请用0.5u的膜来过滤您准备好的缓冲盐。同时要牢记,柱子就是一个非常好的过滤器,如果使用了不纯的溶剂,杂质将会污染柱子,造成不可逆的吸附。那些杂质吸附点,改变了柱子的选择性并会造成色谱图中峰分叉。在梯度洗脱中,杂质会形成鬼峰,所谓鬼峰就是总是在色谱图中同样位置出现的峰,他的来源不是样品,而是杂质的来源的溶剂或者溶剂添加剂。因此在每个方法的开始,不进样的情况下跑一针梯度来测试鬼峰是否存在。避免杂质吸附在柱头,应该用个保护柱,保护柱的使用可以很明显的增加柱子的寿命。另外,保护柱可以过滤来自泵密封圈或者转子密封圈颗粒污染物。代替保护柱的是嵌入过滤,这中过滤是直接附在柱子上,虽然能够避免流动相中的固体颗粒杂质,但是不能避免有机杂质不可逆吸附。

液相色谱柱正确的保存

短期保存,例如过夜,柱子可以保存在上次分析用的流动相中。

稍微长的时间保存,例如2天或者超过一周

长期保存,硅胶基质的柱子应该保存在质子惰性的有机溶剂中,水含量应该不高于50%,最好的储存溶剂是乙腈。

注意!!!确保用乙腈冲洗柱子之前所有缓冲盐已经被冲洗出柱子。缓冲盐在乙腈中不容,并且会堵塞这毛细孔或者柱子。

平衡时间

一支柱子的平衡时间是根据柱子尺寸决定的。一般的,一支柱子是在冲洗20倍柱体积后被平衡。对大部分重要柱子尺寸的平衡时间被概括在如下表格中。

Column dimension

Column volume [ml]*

Flow rate [ml/min]

Equilibration time [min]

250 x 4.6 mm

2,91

1,00

58

150 x 4.6 mm

1.74

1.00

35

100 x 4.6 mm

1.16

1.00

23

50 x 4.6 mm

0.58

1.00

12

250 x 4.0 mm

2.20

1.00

44

125 x 4.0 mm

1.10

1.00

22

250 x 2.0 mm

0.55

0.25

44

150 x 2.0 mm

0.33

0.25

26

50 x 2.0 mm

0.11

0.25

9

*_T = 0,7

更短的平衡时间也可以,如果简单的增加流速,如果没有色谱可用,这也不是什么问题,但是前提必须保证100%的20倍的柱体积平衡。

柱子再生

不可逆转的杂质吸附来源于柱头的基质,导致柱子选择性的改变或峰分叉。常常那些脏柱子是可以再生的通过应用下边一些方案。

反相填料的再生

反相填料是:C18,C8,C4,C1,C30,CN或者苯基固定相。

冲洗20倍柱体积的水

冲洗20倍柱体积的乙腈

冲洗5倍柱体积的异丙醇

冲洗20倍柱体积的庚烷

冲洗5倍柱体积的异丙醇

冲洗20倍柱体积的乙腈

正相填料的再生

正相填料:硅胶,二醇基,硝基(Nitro)和氨基固定相。

20倍柱体积庚烷冲洗

5倍异丙醇冲洗

20倍柱体积乙腈冲洗

20倍柱体积水冲洗

20倍柱体积乙腈冲洗

5倍柱体积异丙醇冲洗

20倍柱体积庚烷冲洗

离子交换色谱柱再生

离子交换包括阴离子和阳离子交换(WCX,SCX,WAX,SAX)冲洗20倍的流动相,但是缓冲盐要双倍浓度

接下来的再生操作同反相填料的操作

冲洗20倍柱体积的水

平衡柱子到初始的条件

聚合物基质色谱柱

聚合物基质的固定相有好的PH耐受性但是机械强度会比较差相比硅胶基质的柱子。另外,聚合物基质填料不适合所有有机溶剂,在某些有机溶剂中会发生溶胀或收缩,不幸的是,不同的厂家不同结构的聚合物固定相压力稳定性和溶剂兼容性也不相同。所以没有常规的规律针对聚合物基质的柱子供大家参考,重复读所使用柱子说明书,如果有什么疑虑,请随时联系相应的生产厂家。

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